GUS染色方法

GUS染液配制

我们使用的是翊圣公司的X-Gluc,下面的protocol也是翊圣公司的。

试剂(母液浓度) 体积(1 ml ) 终浓度
ddH2O 830 μl -
1 M 磷酸钠(pH7.0) 100 μl 0.1 M
0.5 M EDTA, pH8.0 20 μl 10 mM
10% Triton X-100 10 μl 0.1 (v/v)
50 mM 铁氰化钾 20 μl 1 mM
0.1M X-Gluc(50 mg/ml ) in DMF 20 μl 2 mM

以上这些试剂除了EDTA,其他试剂配制比较简单。下面是这些试剂配制的具体方法:

  • 1 M 磷酸钠

    需要称取磷酸氢二钠和磷酸二氢钠各6.659 g和1.778 g,加入25 ml 左右的ddH2O,最后定容到30 ml ,基本上混合均匀完全溶解即可达到pH7.0左右,无需调pH。

    注意:两者混合后一开始可能无法全溶解,需要过个几分钟才可以溶解。

  • 0.5 M EDTA

    我们用的就是Na盐,称取5.584 g,加入20 ml ddH2O,此时看到的是白色沉淀,无法溶解(只有在pH8.0左右的时候,EDTA才能够完全溶解于水中),然后加入0.5 g片状NaOH,此时pH可能还没有到达8.0,然后用9 M的NaOH溶液进行缓慢pH调整,观察溶液是否澄清。澄清时测定pH,调整直到8.0,最后定容到30 ml 。

    当EDTA全部溶解的时候,pH值大概就在8.0左右。

  • 10% Triton X-100

    取0.5 ml Triton X-100,加入到4.5 ml的ddH2O中,使其充分溶解,但是因为是表面活性剂,可能会出现较多的泡沫,静置一段时间后,自然会消失。

  • 50 mM K3Fe(CN)6

    称取0.165 g,加入8 ml的ddH2O,溶解后定容至10 ml。最后溶液的颜色是淡黄色的。

    三价铁容易被还原,因此需要将其避光保存,一旦发现颜色发生了变化,那么就需要重新配制。

  • 50 mg/ml X-Gluc

    1 ml DMF溶解50 mg的X-Gluc粉末,浓度就是50 mg/ml。一般都是现配现用,需要多少用多少。一个样品染色,需要500 μl。根据样品的多少来称取粉末的量,不要太浪费。

染色

取上一步配制好的GUS染液,将你的样品加入其中,然后用锡箔纸包起来,放置于37℃,12h-16h左右,就可以看到靛蓝色。染色具体时间依据实验设计而定,可灵活变动。

显微成像

使用显微镜进行染色结果的记录,拍照可以调整几个参数,曝光值,自动白平衡,基本就这两个参数,尽量将背景拍得明亮一些,显得干净。拍摄之后要记得添加标尺scale,一般需要调整为一致的标尺。

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